摘要:
背景:肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性的前药转化为高毒性代谢产物以杀伤肿瘤细胞,嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统具有目前已知最强的旁观者效应,成为基因治疗领域中的研究热点.目的:研究PNP/fludarabine自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402的体外杀伤效应.方法:应用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增PNP基因,通过8个甘氨酸的接头克隆至真核表达载体pEGFP-M.将pEGFP-N-PNP以Lipofectamine 2000转染BEL7402细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,命名为BEL7402/PNP.应用逆转录(RT)-PCR和RNA印迹法(Northern blotting)鉴定PNP基因的表达.分别应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞的细胞毒效应、旁观者效应和诱导凋亡作用.结果:RT-PCR和RNA印迹法证实转染的PNP基因能在BEL7402和BEL7402/PNP细胞中表达.低浓度fludarabine对经PNP基因转染的BEL7402细胞具有明显的细胞毒效应;旁观者效应检测显示,10%的BEL7402/PNP细胞与90%的BEL7402细胞混合,经低浓度fludarabine处理,90%的细胞可被杀死;细胞凋亡检测显示,PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞具有明显的诱导凋亡作用.结论:PNP/fludarabine自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402有明显的杀伤作用和旁观者效应.
