摘要:
目的：神经干细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞，但其纯化、培养技术尚不完善。通过不同接种密度和传代方法，筛选优化神经干细胞的体外培养技术。
方法：实验于2006—05／12在四川大学移植免疫实验室完成。①动物：选取清洁级孕12-16d雌鼠，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取孕鼠胚胎脑皮质，胰蛋白酶＋乙二胺四乙酸消化组织，分离神经干细胞，加入含B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的DMEM／F12培养基，传至第3代时，调整细胞密度至1× 10^7 L^-1，1× 10^8 L^-1，1× 10^9 L^-1，1× 10^10L^-1进行培养。另取原代培养7～10d后的神经干细胞，收集形成的细胞球，机械吹打法传代是离心后用由粗到细的吸管轻柔吹打，或用带5号针头的无菌注射器吹打分离细胞，操作中避免产生气泡，使用注射器时吹打的次数保持5次。胰酶消化联合机械吹打法传代是离心后加入胰蛋白酶，37℃水浴10min，用由粗到细且经火焰抛光的吸管轻柔吹打，或用带5号针头的无菌注射器吹打，以胎牛血清终止消化。③实验评估：观察第3代神经干细胞生长状态，MTT法检测各密度下培养1，3，5，7d时的增殖情况。计数两种传代方法亚代神经干细胞形成的克隆球数目，比较增殖效果。免疫荧光染色检测神经球巢蛋白、BrdU标记、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达。
结果：①神经干细胞的培养和鉴定：从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞可聚集成球状，并在体外大量扩增和长期存活，巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白均呈阳性表达，免疫荧光染色可见大量BrdU标记的阳性细胞。②不同接种密度对神经干细胞增殖的影响：按1× 10^9 L^-1密度培养的细胞分裂增殖最为迅速，于第7天达高峰，且�
