摘要:
目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂／3-磷酸甘油醛脱氢酶（BmcPI／，BmGAPDH）复合基因重组质粒，并转染人宫颈癌细胞（Hela）进行重组蛋白表达。将重组质粒和相应表达蛋白进行免疫学研究比较。为研制新型的抗丝虫基因工程疫苗提供理论及实验依据。方法扩增周期型马来丝虫目的编码基因。将目的基因片段和载体分别双酶切后进行连接，构建复合基因重组质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI/BmGAPDH，鉴定后转染Hela细胞，以G418筛选转染细胞，进而通过RT-PCR和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。亲和层析纯化所表达的重组蛋白并通过免疫蛋白印迹法（Westernblot）对纯化的重组蛋白进行生物学鉴定。60只BALB／c小鼠分5组，每组12只，第2、4、6周分别免疫1次。磷酸盐缓冲液（PBS）对照组为注射PBS100μl；空质粒／CpG对照组为注射pcDNA3．1100μg和CpG30μg；复合重组质粒／CpG组为注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH100μg和CpG30μ；复合重组蛋白／CpG组为注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH复合重组蛋白50P-g和CpG30μg；复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组前2次注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH100μg和CpG30μg；后1次注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH复合重组蛋白50μ和CpG30μg。用RT—PCR方法检测肌肉组织内目的基因；用酶联免疫吸附试验（ELISA）、特异性增殖试验（MTT法）分别检测免疫小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子干扰素（INF）-γ、白细胞介素（IL）-4水平。结果复合重组质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH免疫小鼠后，从小鼠肌肉组织扩增出目的基因。复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组小鼠免疫4、6周后血清抗体效价（1695．12±1．43、3199．63±1．34）均高于复合重组质粒／CpG组（712．69±1．08、1510．08±1．43，P均〈0．05
