摘要:
围产期窒息所致缺氧缺血脑损伤(HIBD)为新生儿期危害最大的常见病，常导致新生儿死亡和幸存者严重的后遗症。近来报道非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂1-氨基-3，5二甲基金刚烷盐酸(商品名美金胺)（Memantine）对HIBD具有脑保护作用［1］。本研究拟对缺氧缺血（HI）新生大鼠对照应用美金胺，通过观察热休克蛋白（HSP）70基因表达的变化，进一步从分子水平评估美金胺对脑的保护效果。
材料和方法
1.实验对象：7日龄SD鼠，无性别选择，体重10～14 g，分成正常对照（NORM）组、HI组以及HI后给药组，每组15只。
2.HIBD模型的建立：结扎7日龄新生鼠的右颈总动脉，置于自行研制的缺氧房［2］内，在37 ℃、8％氧浓度下缺氧2 h，返回母鼠身边喂养。
3.HSP70基因的检测方法：(1) 制备标本：新生鼠分别于HI后2、24、48、72 h及7 d断头处死。正常鼠亦在相应时段断头处死。无菌操作下分别取右脑皮质约50 mg和海马组织约25 mg，冻存于－80 ℃冰箱内备用。(2) HSP70基因的检测：采用柱离心式组织/细胞RNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程公司产品），进行两组脑总RNA的抽提。应用PE Lamda 10紫外/可见光分光光度计进行RNA吸光度A260值(曾称光密度OD260值)的测定，得出标本总RNA浓度（g/L）。根据HSP70基因cDNA序列，应用Oligo 5.0软件设计长度为19个碱基序列的上游、下游和下游竞争引物(美国赛百胜生物工程公司合成)。竞争性内参照（internal standard，IS）制备过程参照文献［3］，浓度为2fg。依据逆转录试剂盒进行总RNA逆转录，生成RT产物cDNA，然后进行PCR扩增，2％琼脂糖对PCR产物进行凝胶电泳，应用BIO-RAD图象分析系统软件（美国BIO-RAD公司）分析电泳结果，用PCR产物目的条带和竞争条带的容积比值作为HSP70基因的相对表达量。
