基因治疗2.0时代，谁将成为基因药物明日之星？
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1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋结构，开启了分子生物学时代。
1963年，DNA双螺旋结构发表10年，乔舒亚·莱德伯格提出了基因交换和基因优化的理念。
1972年，西奥多·弗里德曼，提出了基因治疗是否可以用于人类疾病治疗的假设。
1984年，Cepko CL成功设计出可以有效地将外来基因插入哺乳动物染色体的逆转录病毒载体系统。
1990年9月14日，美国国立卫生研究院（NIH）批准第一个基因治疗的临床研究，四岁的Ashanti DeSilva第一个接受了腺苷脱氨酶缺陷导致的重症联合免疫缺陷(ADA-SCID)基因治疗。此后，全世界大约有4000名患者参与了500多个基因治疗的临床试验项目。
1999年9月13日，18岁的杰西·格尔辛格死于腺病毒载体基因治疗引起的多器官衰竭，主要原因为免疫系统对腺病毒载体的过度反应。FDA暂停了大部分临床试验，重新对基因治疗的伦理和技术实施重新评估。
杰西·格尔辛格的死终结了基因治疗的疯狂大跃进时代，资本界的寒冬迫使研究者摒弃商业诱惑，重新回归学术和理性。
2006年8月，美国《科学》杂志披露基因治疗成功的治疗了两个患者的转移性黑色素瘤，基因治疗开始逐渐的走出困境。
基因治疗1.0时代治疗失败的原因有2个，一是导入的重组基因被插入到基因组的错误位置，从而激活了致癌基因，二是因为载体病毒引起患者免疫系统的过度反应，从而导致多器官功能衰竭以及脑死亡。
基因治疗2.0时代，研究人员使用了新型高效的病毒将新的重组基因转运到细胞中，从而克服了1.0时代的很多问题。主要包括两种基因疗法，分别以治疗LPLD的Glybera腺相关病毒载体（AAV）和治疗SCID的Strimvelis 逆转录病毒(Retrovirus)或慢病毒（Lentivirus）载体为代表。所谓成也病毒，败也病毒。
Glybera由非复制型腺相关病毒（AAV载体和包裹在其中的LPL重组基因组成。与杰西·格尔辛格致死的腺病毒载体不同，AAV来自细小病毒家族，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。AAV是非致病性的（大多数人携带这种无害的病毒）,与腺病毒相反，大多数用AAV治疗的人不会产生免疫应答。
重组腺相关病毒载体(rAAV) 即将AAV中的cap和rep基因替换成目标基因，如Glybera中的LPL基因（见下图），LPL基因不插入细胞的染色体中，作为独立的DNA自由漂浮保留在细胞核中。由于AAV仅含衣壳蛋白和目标基因，因此具有安全性好、宿主细胞范围广(能感染分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，成为现阶段在世界范围内应用最广的基因载体。目前进入临床三期主要涉及的治疗领域有遗传性视网膜营养不良、血友病等。
提到AAV就不得不提此领域的先锋宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania comprises），没错，就是和药明康德在费城合作建设145,000平方英尺cGMP工厂的那个。Penn发明的AAV2.0技术（Glybera为AAV1.0传统技术）已授权给REGENXBIO（NSDQ：RGNX）进行商业化开发，已经研发出100种以上AAV亚型，约70％处于临床阶段的rAAV项目均采用此技术平台，已经和REGENXBIO合作的公司有ADVERUM、AVEGIS、AUDENTES、SHIRE、BIOGEN、DIMENSION、ESTEVE、LYSOGENE、VOYAGER。目前，Penn公司已发明AAV3.0技术：拥有更强的递送能力和效率，更低的免疫原性，更适合基因组编辑，从而能靶向干细胞和祖细胞（见下图）。
在欧洲估计每年约15名患者发生ADA-SCID，在美国约为12名，常规的酶替代疗法需要每周注射。Strimvelis是第一种离体造血干细胞（HSC）基因治疗，从患者提取造血干细胞并纯化，刷选仅表达CD34+的细胞，然后用含有人腺苷脱氨酶基因（ADA基因）的逆转录病毒GSK2696273 (MoMLV)转导，然后再输注到患者体内(CD34+的细胞浓度为1-10百万个/ml)。这些细胞在人的骨髓中生根，复制并产生成熟的细胞并产生正常起作用的腺苷脱氨酶蛋白。目前18例接受Strimvelis治疗的ADA-SCID患者仍然存活。一项关键性研究显示，所有儿科ADA-SCID患者接受Strimvelis治疗后3年的存活率达100%。Strimvelis只需给药一次，而且不依赖于第三方捐献者，不存在因排斥引发的免疫不相容风险。
逆转录病毒在癌症和干细胞基因疗法中被广泛使用，可以通过表达质粒转导cDNA和shRNA。大多数转染质粒来自MoMLV（莫洛尼鼠白血病病毒）或MSCV（鼠干细胞病毒），其包括包装基因 (Gag-Pol) 和包膜基因（ENV）（见下图）。 Gag是结构性前体蛋白, Pol是聚合酶, ENV可以被改造（不携带表达病毒蛋白的基因），从而改变感染性。长末端重复序列（LTR）基因的存在，其促进重组基因整合到宿主基因组中。
慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒的一种，和普通逆转录病毒不同，可以感染分裂期和非分裂期的哺乳动物细胞。慢病毒的转染需要同时存在包装辅助质粒和包膜辅助质粒制粒（见下图），其中VSV-G包膜辅助质粒可以使慢病毒感染更宽范围的细胞。现阶段慢病毒研究发展得很快，大量使用慢病毒载体的基因药物已经进入临床III期，主要涉及治疗领域有脑白质肾上腺营养不良症、地中海贫血、粘多糖病等。
2014年4月，美国FDA授予Celladon公司旗下的心衰基因疗法MYDICAR“突破性疗法”认定。这是FDA首次批准的基因疗法。
2014年11月，FDA授予Spark Therapeutics公司在研产品SPK-RPE65“突破性疗法”地位，用于治疗由于RPE65基因突变所导致的先天性利伯氏黑蒙症患者的夜盲症。
2015年2月，FDA授予BLUEBIRD公司的LentiGlobin BB305“突破性疗法”认定，治疗地中海贫血病的基因治疗。
2016年7月，FDA授予辉瑞和Spark共同研发的B型血友病试验性新药SPK-9001 “突破性疗法”认定。
2016年7月，FDA授予AveXis公司在研新药AVXS-101“突破性疗法”认定，用于治疗 I 型脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）的儿童患者。
2017年1月，FDA授予uniQure 公司AMT-060“突破性疗法”认定，用于B型血友病的治疗。
2017年2月，FDA授予Tocagen公司其在研疗法Toca 511 & Toca FC“突破性疗法”认定资格，用于治疗复发性高级别胶质瘤（high grade glioma）。
目前，美国尚无真正意义的基因治疗药物上市（反义核苷酸等除外），截止2017年3月，正处于临床III期的药物有13个，其中造血干细胞（HSC）治疗领域3个、肝基因相关领域1个、视网膜基因治疗领域2个、肿瘤领域4个、神经性疾病领域3个（见下表。微信消息发送“基因疗法”，可获得Excel版详细pipeline的下载链接）。
处于III期阶段的基因治疗药物
注：数据来源Cortellis，此表不包含反义核苷酸、核酸适配体、肿瘤疫苗、CAR-T、溶瘤病毒、干扰RNA
在基因治疗领域，Spark和Bluebird为当之无愧的两大明星，分别代表了AAV载体技术平台和Lentivirus载体技术平台的领头羊。
Spark为AAV载体的死忠粉（见下图），其治疗视网膜疾病的SPK-RPE65已经完成三期临床，预计2017年早期向FDA递交生物制品许可申请（BLA）,有望成为第一家迈入美国市场的基因疗法新创公司。Spark还拥有处于I/II临床阶段的SPK-7001（脉络膜缺失症）、SPK-8001（A型血友病）、SPK-9001（B型血友病），均采用AAV病毒作为载体。
Bluebird为Lentivirus载体的坚决拥护者（见下图），治疗ALD的Lenti-D和治疗β地中海贫血的LentiGlobin均处于三期临床招募阶段，尽管LentiGlobin在β地中海贫血中的前期临床数据不理想，导致其股价从194美元一度跌至35美元，但是其治疗镰状细胞疾病的临床（NCT02151526）在2017年迎来开门红，3月2日《New England Journal of Medicine》期刊报道一名15岁患有两年镰状细胞贫血症的法国少年，在接受LentiGlobin治疗后，该男孩已能够产生足够多的正常血细胞。
同时，Bluebird还拥有癌症免疫治疗和基因编辑两大技术平台，其中CART治疗药物BB2121已经进入临床阶段。
以下为部分基因治疗公司的Pipeline，项目太多，在此不做具体介绍。
1
uniQure
2
Gensight
3
VBL
4
Anges
5
Orchard
6
BioMarin （关注BMN270）
7
lysogene
8
Tocagen
9
regenxbio（AAV2.0技术）
10
Moderna（mRNA技术）
Cortellis数据库收录的以Gene therapy为关键词的药物统计结果见下图，处于发现阶段的项目高达974项，处于临床阶段的474项，处于上市及注册阶段的18项。
上述项目与基因治疗相关的公司高达95家（如下表所示），但也可谓是百家争鸣，良莠不齐。
|
AAV Vectors |
4D Molecular Therapeutics |
Abeona Therapeutics | |
Acucela | |
Adverum Biotechnologies | |
Agilis Biotherapeutics | |
AGTC | |
Allergan (Retrosense Tx acquisition) | |
Audentes Therapeutics | |
AveXis | |
Biogen | |
BioMarin | |
CombiGene | |
Dimension Therapeutics | |
Esteve | |
Freeline Therapeutics | |
Genethon | |
Gensight Biologics | |
Global BioTherapeutics | |
Homology Medicines | |
HORAMA | |
Lysogene | |
Milo Biotechnology | |
NightstaRx | |
Pfizer (Bamboo Tx acquisition) | |
REGENXBIO | |
Shire | |
Solid Biosciences | |
Spark Therapeutics | |
Theragene Pharmaceuticals | |
uniQure | |
Voyager Therapeutics | |
|
Lenti/Retroviral Vectors |
Adaptimmune |
AVROBIO | |
Bellicum Pharmaceuticals | |
bluebird bio | |
Calimmune | |
Celgene | |
Cellular Biomedicine Group | |
Cellectis/Pfizer | |
Celyad | |
Editas Medicine | |
EMD Serono | |
Errant Gene Therapeutics | |
Fate Therapeutics | |
Fibrocell Science | |
GE Healthcare Life Sciences | |
Genenta Science | |
GSK | |
Immunocore | |
Insulete | |
Juno Therapeutics | |
Kite Pharma | |
MaxCyte | |
Medigene | |
NexImmune | |
Novartis | |
Opexa Therapeutics | |
Orchard Therapeutics | |
Oxford BioMedica | |
Poseida Therapeutics/Janssen | |
Rocket Pharma | |
Takara Bio | |
Tocagen | |
Unum Therapeutics | |
ZIOPHARM Oncology | |
|
Adenoviral Vectors |
Angionetics (Taxus Cardium |
Pharmaceuticals) | |
Cell Medica | |
GenVec | |
Global Biotherapeutics | |
Aevi Genomic Medicine (formerly | |
Medgenics) | |
PeriphaGen | |
Renova Therapeutics | |
|
Genome Editing |
Biogen |
bluebird bio | |
Caribou Biosciences | |
Cellectis | |
CRISPR Therapeutics | |
Casebia Therapeutics (Bayer/CRISPR) | |
Editas Medicine | |
Homology Medicines | |
Intellia Therapeutics | |
Poseida Therapeutics | |
Precision BioSciences | |
Sangamo Therapeutics | |
Universal Cells | |
|
Enabling Platforms |
Aldevron |
Brammer Bio | |
Cell Design Labs | |
Cognate BioServices | |
EMD Millipore | |
Intrexon | |
Lonza | |
PCT Caladrius | |
PharmaCell | |
Synpromics | |
ThermoFisher Scientific | |
WuXi AppTec |
据Informa统计，2016年全年基因疗法相关企业融资共计28亿美元，相比2015年69亿美元出现大幅下降。下图为近三年基因疗法和细胞疗法的融资总额， 2016年IPO融资情况如下：Intellia $124.2M 、Editas $108.6M 、AveXis $95M 、Audentes $85.1M 、CRISPR $56M 、GenSight €45.2M 、TiGenix $35.7M 、MaxCyte $14.2M 、Cellect $8.4M。
相比作为基因治疗元年的2015年，2016年融资热度的减少对基因治疗长远来说未必是坏事，基因治疗需要一个量变到质变的过程！
虽然目前已经针对多种罕见的疾病成功开发出了基因疗法，像SCID和血友病这样的疾病，这些罕见病都已明确基因突变。但是对于那些具有复杂遗传病因的常见疾病，开发对应的基因疗法则更加困难，诸如阿尔茨海默病、糖尿病和心力衰竭等疾病，它们不仅涉及到多个基因，并且在患有同种疾病的不同病人中，对应的基因突变还不完全相同。2015年4月，Celladon宣布其心衰药物Mydicar 在一个叫做CUPID2二期临床彻底失败，FKD 也暂停了其SCH 721015心衰的适应症。
尽管基因治疗路途坎坷，但是随着crispr/cas基因编辑技术、mRNA新型药物技术的应用和载体技术的不断完善，相信基因治疗彻底治愈常见疾病终究不会是技术问题，只是时间问题罢了。
参考文献：
https://en.wikipedia.org/wiki/Gene_therapy
https://www.technologyreview.com/s/603498/10-breakthrough-technologies-2017-gene-therapy-20/
https://en.wikipedia.org/wiki/Strimvelis
https://en.wikipedia.org/wiki/Alipogene_tiparvovec
https://www.med.upenn.edu/gtp/
张海龙专栏