Science子刊：利用抗CRISPR蛋白显著降低CRISPR-Cas9脱靶效应
（作者：towersimper 来源：生物谷）
CRISPR-Cas9基因编辑是基于细菌产生的保护自己免受病毒感染的策略开发出来的。
图片来自Fuguo Jiang/UC Berkeley.
如今有研究证实病毒进化出的反制措施，即被称作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能够被用来改进作为一种基因治疗工具的CRISPR-Cas9，从而降低可能导致不良副作用的脱靶基因编辑。
在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校的研究人员证实最近发现的抗CRISPR蛋白降低脱靶效应多达4倍，就像一种切断开关那样让CRISPR-Cas9完成它的任务之后失去功能。相关研究结果发表在2017年7月12日的Science Advances期刊上，论文标题为“Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic”。论文通信作者为加州大学伯克利分校创新基因组学研究所研究员Jacob Corn博士和来自加州大学伯克利分校的作为CRISPR-Cas9基因编辑发明人之一的Jennifer A. Doudna。
在这项研究中，这些研究人员让CRISPR-Cas9分子利用向导RNA（gRNA）发现、切割和替换导致镰状细胞疾病的血红蛋白编码基因突变体。他们证实一种被称作AcrIIA4的特定抗CRISPR蛋白将这种CRISPR-Cas9分子的脱靶效应降低4倍。它在做到这一点的同时不会显著地降低想要的在靶基因编辑。
论文共同第一作者、加州大学伯克利分校Corn实验室博士后研究员Jiyung Jenny Shin说，“由于存在脱靶基因编辑，意料之外的突变就能够产生，但是我们的论文像很多其他的论文一样证实能够对脱靶效应加以调整，而且这一点并不像人们可能所认为的那样如此严重。”
在针对人细胞体外培养物开展的实验中，Shin发现运送CRISPR-Cas9，随后在几小时后运送这种抗CRISPR蛋白是最为有效的方法来降低脱靶效应。这种蛋白模拟DNA的作用，将切割双链DNA的Cas9据为已用，从而阻止切割进一步发生。
Shin说，“相比于在靶效应，抗CRISPR蛋白即便在有效的CRISPR作用6个小时之后加入也会降低脱靶效应2倍以上。在治疗上，可能先用CRISPR治疗一名患者，随后利用抗CRISPR蛋白治疗这名患者，就可降低脱靶效应。”
论文共同作者、之前发现了AcrIIA4的美国加州大学旧金山分校研究员Joseph Bondy-Denomy预计这些抗CRISPR蛋白会变成CRISPR基因疗法的一个标准部分。Bondy-Denomy说，“比如，这种Cas9抑制剂（即AcrIIA4）能够与Cas9编码在相同的DNA片段中，在基因编辑完成之后，准确地定时关闭Cas9产生，而不会让Cas9在细胞中停留而冒险产生脱靶效应。”
抗CRISPR蛋白结合
这些研究人员确定了这种抗CRISPR蛋白如何结合CRISPR-Cas9复合体。利用冷冻电镜技术，他们发现这种抗CRISPR蛋白在本质上模拟DNA的作用，诱使CRISPR-Cas9与它结合，随后从不释放。
这种CRISPR抑制剂靶向Cas9蛋白表面上的一个位点，这个位点对Cas9的功能是至关重要的，因此当Cas9被这种抗CRISPR蛋白结合时，它不能够切割DNA。
去年，Bondy-Denomy已报道攻击性病毒用来让在单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）中发现的Cas9蛋白版本失活的4种抗CRISPR蛋白。它们中的两种抗CRISPR蛋白也抑制科学家们最为常见使用的Cas9蛋白，该蛋白源自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes），因而也被称作SpyCas9。另一个研究团队已发现3种其他的抗CRISPR蛋白抵抗一种不同的但有前景的Cas9蛋白，该蛋白源自脑膜炎双球菌（Neisseria meningitidis）。
当前的这项研究探究了来自李斯特菌的4种抗CRISPR蛋白之一的AcrIIA4对装载着一种引导结合和切割互补DNA的gRNA的SpyCas9蛋白的影响。
加州大学伯克利分校和其他地方的研究提示着CRISPR-Cas9持续地欺骗细胞的DNA修复系统：CRISPR-Cas9切割它的靶位点，细胞修复这种DNA，CRISPR-Cas9再次切割，重复这种恶性循环直到DNA中出现突变，这种突变阻止Cas9结合，也正是在这个突变位点上，CRISPR-Cas9继续向前移动以便发现另一个结合位点。
如今，当前的这项来自Corn实验室和Doudna实验室的研究提示着在Cas9成功地对靶基因进行编辑之后，添加一种抗CRISPR蛋白将会阻止基因组中的其他位点遭受不必要的损伤。
Corn说，“关闭Cas9基因编辑的能力与开启它的能力同样重要。想象一下，如果你有一把没有关闭开关的电动剃刀！就最终的治疗应用而言，能够精确地控制在何时和在何处进行基因编辑是至关重要的。这些抗CRISPR蛋白为完全关闭Cas9和微调它的活性提供机会。”
Bondy-Denomy说，“Shin的数据提示着存在一种理想的让Cas9在一段时间之内完成它的任务随后将它关闭的时间窗口。我们实际上能够利用这些抗CRISPR蛋白作为工具找出这种时间窗口，也就是对任何一种细胞类型和任何一种gRNA而言，我们想要Cas9在细胞中多长时间保持活性。”
原始出处：Jiyung Shin, Fuguo Jiang, Jun-Jie Liu et al. Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic. Science Advances, 12 Jul 2017, 3(7):e1701620, doi:10.1126/sciadv.1701620
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