HIV 阳性患者尿液中外泌体分泌的HIV-1和人蛋白的检测

细胞外囊泡（EVs）是膜结合囊泡，大小在30nm到1之间，分泌到血液，尿液，唾液，精液和其他体液中，并且已被认为是疾病进展的生物标志物的潜在来源。这些 EVs，微粒和/或外泌体通常由细胞分泌或当它们经受应激或凋亡时，并含有蛋白质，mRNA和miRNA参与细胞间通讯，细胞内通讯和抗原向细胞转移的过程。EVs在艾滋病毒感染，其他病毒感染以及心血管，肾脏，肝脏和代谢性疾病基础的癌症患者中，其癌症发病机制中有所描述。

来自尿液的外泌体是一种无创性疾病生物标志物来源。在健康个体中，蛋白质仅占尿液成分的0.01％；然而，在某些疾病状态下，尿液中蛋白质含量和外泌体数量会增加。肾小球囊过滤血液进入肾小管，其中的蛋白占尿蛋白含量的百分之三十。尿液中剩余的百分之七十的蛋白质来源于肾脏，因此尿液外泌体包含肾脏来源和其他成分。

在HIV +患者的外泌体中检测到HIV蛋白，其中HIV Nef是最常见的蛋白。其他关于外泌体中HIV蛋白的报道来自体外转染或HIV感染的培养细胞，而不是来自HIV +患者样品。

尿液外泌体的生物标志物被建议用于诊断许多疾病状态。本研究的目的是利用蛋白质组学和质谱确定来自HIV +患者和HIV-个体的尿EV的蛋白质差异。对更多患者样品的分析可以将具体的外泌体尿蛋白鉴定为HIV感染，治疗功效和/或疾病进展的生物标志物。

3.1.艾滋病毒阳性患者的尿路感染中存在HIV蛋白。LC / MS / MS质谱法HIV 外泌体蛋白质结果列于表2。满足作为HIV-1蛋白的错误发现率和Xcorr评分标准的尿外泌体蛋白包括Nef，Gag，Pol，蛋白酶，gp120，gp160，gp41，Rev，逆转录酶，Tat，Vif，Vpr和Vpu。所有艾滋病毒阳性的尿液样本（= 35）在外泌体中至少含有一种HIV-1蛋白，而在HIV阴性样本中未检测到HIV蛋白（= 12）（表3）。HIV-1 Nef在35个HIV-1尿样中有26个检测到（74.3％）。表格（3）患者的尿液样本，＃173，＃174和＃196，分别在203,311和35天进行测试，分析他们的第一个外泌体样本。发现样品＃196中检测到的HIV蛋白与它35天前的没有差异。＃173的样本在第一次分析后进行了203天的测试，具有类似的轮廓，除了没有检测到Rev和Tat。此外，＃174的外泌体在第一次采样311天后检测到配置中缺失Rev和RT。

通过LC / MS / MS只能检测到35例患者中的5例（14％）样品中的HIV p24抗原，但在26例HIV阳性和11例HIV阴性样品中检测到HIV p24抗原通过ELISA测试，没有检测到p24。用CD4 + T细胞计数，病毒载量或ART疗法检测到的HIV蛋白质数量没有统计学相关性。

通过使用多克隆汇集的患者血清和针对HIV Nef和HIV p24的单克隆抗体的WB分析进行的验证表明存在HIV蛋白。图1是使用多克隆混合HIV +血清作为检测抗体的WB。所有HIV +患者样品都含有HIV-1蛋白质，上图显示患者样品对抗HIV Nef反应。HIV +尿液样本中，9例中有7例（77.7％）在27 kD处显示HIV-1 Nef条带。

3.2.外泌体的TEM和NTA分析。来自HIV +患者的尿液透射电镜分析显示多个EVs，大小在50 nm到300 nm之间（图2（a）），而两个HIV阴性对照的EV几乎没有（图2（b））。NTA分析显示，HIV +患者的EVs显著多于健康对照，分别为4.96±0.0733和3.69±0.075（<0.05）。在外泌体的大小方面，HIV-捐献者和54-448纳米HIV+样本的110-227纳米没有显着差异。图3显示了HIV阴性和HIV +尿液样品的代表性Nanosight分析结果。

3.3. HIV +和阴性尿样本中的外泌体蛋白质。来自HIV +患者的外泌体蛋白14,475进入FunRich功能性富集分析软件，显示29.44％或1,932种蛋白与外泌体相关（表4）。这些外泌体蛋白质与ExoCarta数据库中排名前100的外泌体蛋白质进行了比较，匹配率为83％[33]，EV阵列中的22种EV蛋白质类似[14]，在来自HIV感染淋巴细胞的外泌体中鉴定出14种EV蛋白质中的7种[36]被发现并在表4中突出显示。表5列出了对照样品中发现的外泌体蛋白。

表6和图4总结了来自HIV +样品的EV的FunRich分析的结果。表达的前五位（<0.01）EV位点是内皮细胞，血浆，肝脏，血清和肾脏，最显着的细胞成分是溶酶体，外泌体，膜，质膜，细胞核和细胞质（<0.01）（图4）。前5种本体（表6）是蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性，催化活性，GTP酶激活剂活性，鸟苷酸 - 核苷交换因子活性和细胞粘附分子活性（<0.0001），最重要的生物学过程是核碱基，核苷，和核酸（<0.0001），最显着的生物学途径是整合素细胞表面相互作用（<0.03）。

LC / MS / MS鉴定了HIV +患者外泌体中的15,571种蛋白质.途径分析类似于来自具有大于300个CD4 + T细胞和低VL的患者的EV蛋白质，并且在低CD4 + T细胞和高VL之间不同（总结在表7中）。找到的路径在补充材料1中详细介绍。检测到的白细胞介素蛋白IL10，IL10RA，IL16，IL17RC，IL18，IL18BP，IL1RAP，IL1RL2，IL1RN，IL33，IL4I1，IL6和IL6ST。除了MHC I类和II类抗原之外，还通过LC / MS / MS发现了免疫调节分子HOXB4，CD81，CD9，TGF-β，IDO，Notch1，ADAM17，Rab4和HGF。

图1

图2

HIV-1人类相互作用数据库检索发现，HIV Nef与总共有770种人类蛋白的559种外泌体蛋白相互作用（72.6％）;HIV Vpr与598人的437 EV（73.1％）相互作用;HIV Vif与310人（52.2％）的162 EV相互作用;艾滋病毒Vpu与HIV-EVs中发现的165种人类蛋白质相互作用（67.6％）（见补充材料2，包括用于参考的PMID）。

表8列出了控制外泌体的功能分析。表达的主要部位是宫颈阴道液，中性粒细胞和胃液（<0.0001）。最重要的本体是蛋白质的分子功能和防御/免疫蛋白质活性，主要生物学过程是免疫应答，信号转导，细胞通讯和抗原呈递（<0.0073）。

在HIV +和对照外泌体样品之间只有64种蛋白质重叠，列于表8。用于细胞成分的前十四（14）个本体包括胞外外泌体，细胞外区，细胞外空间，血红蛋白复合物和血液微粒（<0.001，表9），用于分子功能的本体是肝素结合，离子门控活性和氧转运蛋白活性以及发现的最显着的生物学过程是对酵母的应答，对真菌的防御反应，巨噬细胞趋化性，宿主中共生体生长的负调节，氧运输和过氧化氢分解代谢过程。

这是通过质谱和蛋白质印迹检测来自HIV +患者的含有HIV和人类蛋白质的EVs的第一份报告。EVs通过将其货物，核酸，miRNA和蛋白质递送到受体细胞[3]中提供细胞间通讯。以前的研究发现艾滋病病毒+患者血浆中的EV，但没有描述艾滋病病毒或人类蛋白质。 其他人已经描述了含有HIV蛋白质的EV，但这些结果来自体外HIV感染的细胞培养物，而不是来自HIV +患者。 这项研究详细介绍了艾滋病病毒+患者的尿路感染中发现的HIV和人类蛋白质。

根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）的资料，EV的最低要求或其在样品中的存在包括同时检测跨膜蛋白和具有膜/受体结合能力的胞质蛋白，而主要的细胞器则不存在。LC / MS / MS分析鉴定了这些蛋白质，功能富集分析确定了显着性数目，其在HIV +，1932和HIV-中都是外源体来源，仅37位.HIV +和HIV-尿液的TEM分析显示多效膜界面两组尿液样本中的囊泡和NTA分析显示两组中的颗粒大小在50nm至300nm范围内，尽管HIV +样本比未感染样本具有明显更多的颗粒。其他研究发现HIV +患者血浆中EV的数量有所增加。来自HIV +和HIV-个体的蛋白质与外泌体蛋白质显着相关，进一步证实了我们的假设，即来自HIV +患者的尿液含有EVs（表10）。表达位点的FunRich分析显示显着数目的蛋白质与内皮，血浆，血清，肾，肝和肺相关。这些结果表明来自艾滋病病毒+患者的EV可能会从这些部位被过滤掉，并集中在尿液中。

之前在HIV +患者的尿中检测到HIV;然而，它表明，HIV病毒颗粒与细胞团粒有关，而不是在离心尿液中。 p24在复制型HIV感染性病毒颗粒中发现，但在我们的26个HIV +样品中未通过ELISA发现，并且通过LC / MS / MS分析仅有三十五个HIV + EV尿样品具有可检测到的p24。尿沉淀中的p24来源于单核细胞，但仅在80个分析样品中的3个中发现。这代表了低敏感性，主要是因为在HIV感染的晚期阶段HIV-1 p24蛋白并不总是存在。 为了进一步确定这些HIV蛋白来自EV，我们测试了来自HIV阳性尿的超速离心（MW 100,000kD）的滤液，并且没有HIV蛋白存在。 然而，我们并没有对孤立的尿道EV进行HIV感染性分析，MAGI，因此不能完全确定HIV病毒颗粒不存在于EV中。 尿液中的HIV蛋白可能是肾脏非生产性HIV感染的结果[52-56]和/或从血液中流出的EV。 EV中的HIV蛋白质类型保持相对恒定，如第一个样品具有相似结果的203例和311例患者重新取样所证实。 尿液中EV蛋白的鉴定可能是监测HIV疾病状态以及治疗效果的潜在无创诊断工具。

在（1）CD4 + T细胞> 300对<300和（2）VL <200对> 200拷贝的EV中发现不同的蛋白质和途径。 有趣的是，来自低VL和高CD4 + T细胞的HIV +患者（通常指示更好的健康）的EVs具有比来自高VL和低CD4 + T细胞的EV更高的蛋白质（高VL = 2486vs低= 15028;低CD4 + T 细胞= 2115对高CD4 + = 15761）。 这些小组也有重叠的途径结果; 然而，来自高VL和低CD4 + T细胞的蛋白质没有相似的途径结果。 进一步比较和分析低VL /高CD4 + T细胞与高VL /低CD4 + T细胞之间的EV蛋白表达谱可揭示涉及HIV感染进化病理学的更多机制。

EV中所含的蛋白质既可以增强也可以抑制宿主对先天性，炎症性和适应性反应的反应。来自HIV +患者的蛋白质显示出主要的免疫抑制特性。IL10是T2细胞因子，下调巨噬细胞功能并抑制T细胞增殖，IL6可刺激IL10产生并抑制TNF-α和IL1的作用。这两种细胞因子均存在于HIV+患者的EVS中，而TNF-α和IL1未被检测到，提示EVS可能引起免疫调节效应。其他免疫下调因子IDO, HOXB4, HGF, and TGF 被发现。IDO [58], HLA-G 和 HGF 可以抑制自然杀伤细胞激活，这是高CD4 + T细胞和低VL患者中EV蛋白质途径分析中发现的最重要的生物学过程之一。TGF β-1 ，一种免疫功能抑制剂，由HIV Tat诱导，是HIV感染中免疫抑制的调节者。这些蛋白在HIV+患者的EVs中发现，而前列腺炎细胞因子则不存在。新的研究表明，HIV +非进步者血浆TGF-β1和IL10比进展性疾病的患者低，并且EVS有可能隔离TGF-β1和IL10并将它们从循环中清除。在HIV+患者的EVS中存在超过16个不同的MHC I类和II类抗原可以支持这样的假设，即该机制被细胞内病原体用于通过降低细胞毒性T细胞活性来逃避免疫应答。单纯疱疹病毒1结合HLA-DR抑制抗原呈递，导致免疫逃避。未来的研究应集中于这些因素的浓度与HIV+患者的临床状态的相关性。

在这项研究中，我们发现在艾滋病病毒+患者的尿液EV中可以检测到结构，调控和辅助HIV蛋白。 我们使用多克隆和单克隆抗体的WB分析证实HIV +患者中EV蛋白存在。 最普遍的蛋白质是HIV Nef。 来自体外和患者样本的EV先前已经在[6]中进行了评论。 HIV Nef利用Notch-1，ADAM17和Rab4 +诱导TNF诱导的替代途径，这些途径都发现于HIV +患者的EVs中，导致血浆TNF水平升高[68]。 EV中这些因素的分离是否代表TNF产生的减少或增强仍有待研究。

HIV人类相互作用数据库发现HIV Nef，Vpr，Vif和Vpu与人类蛋白质之间的重要相互作用。 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在T细胞受体信号传导中很重要。 HIV +样品中的EVs中发现了激酶以及CD4和MHC抗原; 然而，需要进一步的研究来确定与艾滋病病毒感染相关的机制。 细胞粘附分子ICAM，VCAM和PECAM也在患者EV中发现。 其他人则报道这些分子存在于HIV +血液样本中，并且可能代表了由于HIV感染导致的从充气内皮中获得的生物标志物。

本研究的局限性之一是样本量小的特定HIV综合征，如合并症，艾滋病，HIV相关性肾病和HIV相关性痴呆以及患者接受或不接受抗逆转录病毒疗法。 增加这些类别中HIV +患者的数量可能使我们能够确定特定的HIV蛋白以及尿液EV中的人蛋白是否可以与这些病症相关联。 未来的研究还将量化HIV蛋白质以及人类蛋白质的量，以确定不同的HIV条件与检测到的蛋白质的量之间是否存在相关性。

艾滋病病毒感染通常通过HIV抗体检测，可能需要长达三个月的时间才能发展或通过测量血液中的VL，而我们可以检测出尿液EV中的HIV-1蛋白。 总之，来自HIV +患者的EVs中的尿蛋白可以允许非侵入性方法（1）快速筛选感染和确认符合抗逆转录病毒治疗（ART）的患者; （2）监测ART疗效; 和（3）诊断HIV合并症。

文章来源：exosomes

图片来源：exosomes

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