摘要:
目的建立致病性钩端螺旋体（钩体）TaqManReal-timePCR检测技术。方法以钩体16SrRNA基因的部分片段rrs基因作为靶基因，设计引物、TaqMan探针，PCR产物克隆到pMDl9-T载体，制作标准曲线，建立定量分析质控标准。利用中国15群15型致病性钩体参考菌株、16群21型非致病性钩体参考菌株、50株不同血清群致病性分离株及伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等27株其他常见致病菌检验引物、探针的灵敏性、特异性。将Real-timePCR、普通PCR同时应用于倍比稀释致病性钩体染色体DNA及25份现场鼠肾标本的检测。结果建立、优化致病性钩体Real-time PCR技术，致病性钩体扩增荧光信号阳性，非致病性钩体及其他非钩体菌均无扩增。对于倍比稀释的质粒标准品，Real-timePCR和普通PCR的最低检测下限分别是10copy／μl和10。copy／μl。对于倍比稀释的钩体染色体DNA，两者的最低检测下限分别为：100fg／μl和1ng／μl。25份现场鼠肾标本检测显示，两种方法的检测结果一致。结论以rrs为靶基因建立的Real-timePCR技术，具有较高的灵敏度和特异度，可用于致病性钩体的病原学检测。
