【易企说】回顾：当微流控遇到液态活检，微流控在捕获CTCs领域的进展
微流控技术近些年广受国内外关注，在器官芯片、组织器官培养、即时检验、临床诊断等方面有较为广泛的应用。易企说线上沙龙邀请到无锡纳奥生物医药有限公司创始人亓立峰博士，分享《微流控技术在肿瘤液态活检中的应用》。
相比传统肿瘤手术、创伤的检测方式，液态活检无创便捷，并且可以实时进行监测，使其成为国际研究领域及临床领域关注的重点。如今发展较为成熟的技术是ctDNA和CTC。
ctDNA常用数字PCR进行研究，其对微量DNA的检测，包括微量的突变有广泛的应用前景，是目前发展的一个重要方向。如今数字PCR可以分为两类，一个液滴类的数字PCR，还有一个是微流控数字PCR。
数字PCR ctDNA检测的应用主要是检测稀有突变和拷贝数变异分析，在基因表达分析以及甲基化位点分析可以准备实现。其对用量使用，试剂的使用，分析，后期非常好的操作性和便捷性。但在通量性等方面还需要继续提升。
循环肿瘤CTC相比ctDNA有自己的优势，微流控在该领域也有非常重要的作用。大家都知道，CTC在血液中非常稀少，如何实现CTC的捕获是关键。如今CTC捕获有三个关键技术瓶颈需要突破。
1、有效提高捕获率；
2、实现较高细胞纯度，保持完整细胞活性。
3、提升通量，包括样本数量处理能力和样本体积的处理能力。
➤ CTC分选方法
捕获CTC，可以在以下几个方面进行分选：
1、抗原结合亲和性分选；
2、使用细胞物理特征分选；
3、免疫磁珠；
4、电学性能差异。
亲和性分选法
优点是抗体依赖微流控的分选，表型CTC是有一定的捕获效益和特性；
缺点是会漏选其他类型的细胞。
微流控结合细胞大小和变形
利用细胞尺寸大小还有通过不同微流控管道处理后的细胞变形进行分选。
优点是操作简单，不需要预处理，成本较低。
缺点是CTC分选尺寸为8微米，接近白细胞尺寸，会漏检小粒径循环肿瘤细胞。
免疫磁珠法
将添加有抗体包被磁珠的样品引入微流控芯片，增加了磁珠和血液细胞接触的机会，让磁珠充分混合，提高捕获效率。
缺点是仍然依赖于抗体阳性富集法，只能识别某一类抗原的CTC，会漏检其他抗原表型的细胞。
双向电泳分选法
通过不同标志物的表达，将尺寸相似，形态相近的细胞分离出来，直接对细胞进行选择性操控，无需依赖特异性表面标志物，方便计数，准确率高，分选时间长。此类技术稳定性和性能还需要进一步临床验证。
➤ 第三代CTC检测技术
CTC在液态活检中有非常大的临床价值，对免疫类、细胞培养等肿瘤的临床分析，诊断分析，肿瘤预后评估等领域意义重大。
而一、二代CTC技术并不能满足临床需要，因此第三代CTC技术（比如Nextctc）应运而生。Nextctc通过微流控方式进行基于生物特性以及物理特性来进行有效的分离，可以应用于各类实体瘤，而且灵敏度到达了临床需求。准确率针对不同的癌瘤有一定的差异，肺癌最高的，其他一些肿瘤也在90%以上。
Nextctc循环肿瘤活细胞捕获仪主要是解决关键问题：
1、用非抗体捕获技术将血液里面非常微量的CTC捕获，并且完整保存了CTC细胞活性。
2、循环肿瘤进行有效的鉴定，鉴定的方法也可以用传统的方法，像常规抗体标志物进行一些鉴定，或者结合了免疫荧光，包括细胞病理学进行后续鉴定和检测。
Nextctcf相比于第一、二代CTC捕获技术，在捕获率、细胞纯度、细胞活性等分离性能方面有了质的飞跃，最关键一点可以进行CTC后续药敏实验和单细胞测序工作，应用于肿瘤精准医疗。
Q：您觉得目前国内肿瘤液态活检的市场发展情况如何，产业化方面大家都到哪一步，相应的瓶颈是什么？
亓总：目前在液态活检主要围绕CTC和ctDNA两个方面开展，大部分做肿瘤液态活检的企业在ctDNA方面，他们依赖于血清DNA测序，也有很多资金投入。但是ctDNA的瓶颈在于对临床测序数据的解读，以及对临床指导意义的落实。
ctDNA测序相对容易实现，但是测序的所有基因位点，对临床指导意义是什么，这是需要进行进一步深化研究。同时也需要制定相关行业标准，以及真正做一些对患者有临床价值的ctDNA检测。
而CTC目前国内有10家左右企业在进行相关的产品开发。在对技术进行一个升级优化的同时，第三代技术的研究也在开展。CTC技术瓶颈在于CTC捕获，尤其是活细胞的捕获，这使得CTC的技术门槛相比ctDNA更高，导致现在从事CTC研究及临床应用的企业相对少一些。
Q：目前CTC领域的临床应用主要包括哪些方面？液态活检与精准医疗在您看来应该是怎样的一种关系？
亓总：CTC的临床应用目前来讲，从第一代临床开始主要是预后的评估。目前我们认为非常有前景的是，基于CTC后续检测的个性化用药指导，它们真正能够服务临床患者，能够指导肿瘤患者实时临床用药。
第二个临床应用是复发检测和疗效评估，对于一些不容易获取到二代穿刺样本的患者是非常意义的，并且可以实时检测靶向用药的变化。比如说靶向药用完以后，有没有产生耐药。这个情况下CTC是非常有效的样本来源，可以检测里面细胞的耐药基因突变，虽然ctDNA也可以做，但是ctDNA只可以做DNA水平的用药检测，RNA水平以及蛋白水平用药检测，只能通过CTC来进行实施检测。
除此之外，需要大力推广早期诊断，CTC可以在早期检测出肿瘤细胞。从我们自己的临床数据而言，肿瘤一期就可以检测到循环肿瘤细胞。CTC捕获灵敏度完全可以实现早期诊断的，这是在CTC临床应用未来的发展方向。
至于和精准医疗的关系，精准医疗主要是包括两个方面，第一个是精准诊断，第二就是精准治疗，你只有实现了精准诊断才能针对性的指导用药。而肿瘤细胞病理学判断仍然是肿瘤诊断的金标准，所以说CTC在精准诊断方面将发挥不可替代的作用。
精准治疗目前主要还是围绕靶向药，基于基因突变靶向用药。比如说基因水平的现在通过测序，用CTC测序，还是ctDNA测序。还有用药指导，很多靶向药不仅是DNA突变用药，还有阳性表达的一些用药，像现在抗体药，比如PD1抗体，这需要检测对应受体表达情况，只能通过CTC来检测，才能预测PDL-1受体表达的水平。这个也是CTC不可替代的优势所在。
还有一个方面，除了靶向用药精准治疗方面，还可以探讨细胞的药敏，药敏实验在临床领域医疗方面可以大有作为一个方面。
Q: CTC单细胞测序的开展有哪些困境？
亓总：基因测序相对来讲，无论是什么测序，首先要把单细胞捕获下来，第一捕获是关键点，第二是进行单细胞的分离，如果捕获下来是一团细胞，不是一个单分散细胞，就不能实现单细胞测序。
还有是进行测序，如果进行单细胞分选以后，基因测序相对来说是比较容易的。关键是RNA测序，这个难度更高一点，因为RNA测序对细胞活性要求是非常高，如果是死细胞的话，就不能实现RAN水平的测序。如果实现单细胞RNA测序，首先要保证细胞的活性，只有活细胞的捕获，才能实现单细胞RNA测序。
也就是说CTC单细胞测序从三个步骤，第一个是活细胞的捕获，第二是单细胞分选，第三是单细胞测序。
Q：cellsearch已经停产了，那您认为下个能为广大接受的ctc富集分离技术路线是怎样的？
亓总：我觉得首先只有被临床认可，能够解决临床问题的技术路线才能进行大力推广，为什么cellsearch停产，因为它具有一定的局限性，并且只能捕获某一类循环肿瘤细胞，以及无法进行后续用药检测。
所以接下来的技术首先要满足较高的捕获效率，不仅能够捕获上皮来源，也可以捕获干细胞来源等等。
第二个是活细胞的捕获，只有活细胞的捕获才能有效实现下游的实验，无论是在PCR检测，还是在单细胞测序。我认为Nextctc是从市场认可度来讲，在北上广最有名一线三甲医院得到了认可和推广。希望能够服务于更多临床患者。
Q：目前纳奥生物发展什么阶段，接下来在什么方面开放合作的机会？
亓总：目前我们纳奥生物在产品开放方面，首先Nextctc循环肿瘤活细胞仪器已经获得注册许可，目前在接近30家三甲医院已经开始使用我们的技术进行循环肿瘤细胞捕获检测，主要是应用在肿瘤个性化用药，复发检测等评估方面的临床应用。后续的发展方向方面，我们将陆续推出第二代、第三代Nextctc升级产品，围绕CTC仪器以及配套试剂的开发。还有一些肿瘤早期诊断试剂盒，也在陆续推向市场。
同时我们是一个平台化的技术，最关键发展方向建立整个基于CTC，应用于肿瘤早期诊断、鉴定肿瘤早期诊断新标志物、以及实现抗肿瘤药物筛选的技术平台。我们计划会进行一些单个癌肿CTC细胞库和基因库的构建，将来会作为一个耐药性肿瘤新药筛选平台。
在合作方面，非常乐于去与行业内同行进行广泛合作，我们在CTC单细胞测序分析，目前得到了深度的开展，我们希望在跟测序领域方面专家进行一个合作，包括与生物制药公司进行新药研发平台方面的开发推广。
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生物医学互助平台 蟠桃会 胞外囊泡与外泌体
下一期，【易企说】会和大家讨论微流控在液态活检领域的临床转化，9月20日周二晚8点18分，安可济临床事业部总监侯瑛博士受邀做客【易企说】线上沙龙，讲解《液体活检技术行业的困局及出路初探》，分享安可济在临床应用中的丰富经验。
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