现代生物技术分析 金老师部分 重点总结
由于现代生化技术张老师的部分有提纲，这里建议大家根据提纲复习就可以了。金老师给我们讲的重点包括BCA法、考马斯亮蓝法测蛋白质含量、蛋白质免疫、Elisa、Western、杂交法测核酸、PCR和qRTPCR。光学检测法和糖类物质的检测重点不多，光学检测法主要掌握朗伯比尔定律；糖类物质主要掌握二硝基水杨酸法，这两章的其他知识有可能会出现在综合题里面，希望大家可以自己看一下ppt。最后祝大家考得好成绩！
蛋白质（含量）的化学检测
凯氏定氮法
原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮被氧化生成NH3，氨与硫酸结合成(NH4)2SO4。然后加入碱液蒸馏，生成NH3逸出，被已知量的硼酸吸收后生成硼酸铵。硼酸铵以标准盐酸或硫酸溶液滴定。如果测得一个样品中N元素的含量/浓度为X，则其蛋白质的含量/浓度可粗估为
6.25X。该系数6.25被称为“蛋白质系数”。每一类样品的蛋白质系数都不一样，大多都在6附近。
局限性：
1）不同蛋白质的蛋白质系数不一样别，
2）含氮化合物（如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等）使测定结果不准确，故结果称为粗蛋白质含量
BCA法
测定原理：在碱性环境下，蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA试剂与 Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
优点：不同蛋白质之间差异小；对表面活性剂的容忍度好；操作简单方便
缺点：不能容忍样品中的还原剂；反应需要控制温度，时间较长
考马斯亮蓝法（Bradford法）
在酸性溶液中，考马斯亮蓝（CBB） G-250与蛋白质结合，使染料本身的最大吸收峰由
465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，其吸光度与蛋白质浓度成正比，因此可用作蛋白质含量的测定。
优点：干扰物质少。K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法并且可以较好地容忍蛋白质样品溶液中的还原剂。
缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用IgG为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
干扰物质：去污剂和表面活性，如：Triton X-100和SDS
蛋白质免疫：
基础知识
免疫的概念：免疫（immunity）指生物机体识别和排除抗原物质的一种保护性反应。包括非特异性免疫（先天免疫 innate immunity）与特异性免疫（后天免疫adaptiveimmunity）
免疫的生理作用：
识别“自我”和“非自我”的物质：免疫系统对自身的物质不起反应，而对外源或体内改变了的物质则发生免疫反应，排除其对机体的危害，维持机体自身的稳定性。
先天免疫 （innate immunity）： 包括一系列的细胞及相关机制，可以以非特异性的方式抵御外来感染。先天免疫系统的细胞会非特异地识别并作用于病原体。与后天免疫系统不同，先天免疫系统不会提供持久的保护性免疫，而是作为一种迅速的抗感染作用存在于所有的动物和植物之中。
后天免疫（adaptiveimmunity）：也称“获得性免疫”，是一种经由与特定病原体接触后，产生能识别并针对特定病原体启动的免疫反应。
抗原（antigen）：任何可以为抗体所识别而结合的物质。这种性质叫做“免疫反应性” immunoreactivity
免疫抗原（immunogen）：除可为抗体识别，还能够刺激淋巴细胞产生抗体。后者这种性质叫做“免疫原性” immunogenicity。
完全抗原（completeantigen）：即具有免疫反应性（可以为抗体结合和识别），又具有免疫原性（可刺激抗体的产生）。
半抗原（hapten）：只具有免疫反应性，没有免疫原性。有些半抗原与蛋白质载体（carrier）结合后可具有免疫原性。
一种抗原的免疫原性是由其化学性质和宿主因素决定的。总而言之分子量越大，结构越复杂的分子免疫原性越强。蛋白质最强、糖类、部分多肽类激素（胰岛素）次之、核酸几乎没有
免疫佐剂：能显著增强免疫原性，如微生物及其产物、多聚核苷酸、弗氏佐剂（抗原水溶液+油剂+乳化剂，分枝杆菌等）、无机物如明矾及氢化铝等
两种常见的哺乳动物抗体：
IgA：160kDa，二聚体。存在于粘膜组织，例如消化道、呼吸道以及泌尿生殖系统，以避免遭到病原的入侵，也存在于唾液、泪液以及乳汁当中，尤其是初乳，其IgA的含量相当高。
IgG ：150kDa 单体。 人体抵抗病原入侵的抗体相关免疫力主要由IgG提供，也是
唯一一种可以穿过胎盘为胎儿提供被动免疫力的种型。
抗原表位（antigenicepitope，表位，抗原决定簇，antigenicdeterminant）：是指抗原表面上决定抗原特异性的化学基团。抗原表位可被免疫系统（尤其是抗体、B细胞或者T细胞）所识别。
抗体决定簇（paratope）：抗体中能识别抗原表位的区域叫做“互补位” （complementaritydetermining regions，CDRs）或“抗体决定簇”。是Fv区中，一个15～20个氨基酸组成的小区域，包含重链和轻链各一部分。
抗体的分类：
单克隆抗体（单抗，monoclonal antibody, mAb）：由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备。
特点：由于是细胞培养的产物，批间差异小易于标准化，发生非特异性结合的概率极低。但是只针对一种抗原表位，结合能力较弱，理化性质不稳定。
多克隆抗体（多抗，polyclonalantibody, pAb）：由免疫动物产生的多克隆抗体的血清，质量不稳定，其本质是由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白。
特点：多抗能识别特定抗原上的多个表位。结合能力强。由于是实验动物产生的所以批间差异大，不易于标准化，发生非特异性结合的概率很大。
抗血清（antiserum）：使动物产生免疫反应后得到的含有多克隆抗体的血清（成分=特异性针对目标抗原的抗体+其它所有抗体+血清蛋白）。
应用部分一
抗原-抗体反应的应用：
1）用已知的特异性抗体检测未知的抗原
2）用已知的抗原检测未知的抗体
常见的形式：
1）凝集反应（agglutination）：颗粒性抗原+抗体+电解质→凝集现象。常用于定性或半定量检测
2）沉淀反应（precipitation）：可溶性抗原+抗体→沉淀现象。同抗体比较，抗原的分子小，单位体积内含有的抗原量多，做定量试验时，为了不使抗原过剩，应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价
3）中和反应（neutralization）：抗原（病毒或毒素）+抗体→抗原毒性丧失。将抗血清与病毒混合，经适当时间作用，然后接种于宿主系统以检测混合液中的病毒感染力。宿主系统可以是鸡胚、动物或细胞培养物，根据病毒性而定，目前大多采用细胞中和试验
4）补体参与的反应：抗原+抗体+补体→溶菌反应or溶血现象
A．溶菌反应
某些革兰氏阳性菌，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在条件下，形成抗原抗体复合物，
如加入补体，则出现细菌溶解现象，称为溶菌反应。
B．溶血现象
红细胞与相应抗体特异性结合后，在有足量补体存在条件下，补体能与红细胞-抗体复合物结合，破坏红细胞，出现红细胞溶解的现象，称为溶血反应。
应用部分二
非标记免疫分析技术
1）免疫扩散，
2）免疫电泳
标记免疫分析技术
1）酶免疫分析
2）荧光免疫分析
3）放射免疫分析
4）化学发光免疫分析
酶免疫分析（enzymeimmunoassay，EIA）：以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
(酶标记的抗体，就是利用化学方法把酶和抗体连在一起，同时两者保持自己的功能)
ELISA（酶联免疫吸附分析，enzyme-linked immunosorbent assay） ：将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 如聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，并通过酶催化的显色或发光反应等得到检测。其目的一般是检测特定抗原的存在或含量。
步骤：
1）将针对该抗原的特异性抗体①（捕获抗体）吸附/包埋在微量反应板表面。
2）洗涤（除去未牢固吸附的抗体）
3）加入待测样品，温育（如含有该抗原，则形成Ag-Ab①复合物）
4）洗涤（除去样品中未能和抗体①结合的物质）
5）加入针对该抗原的特异性抗体②（检测抗体，抗原表位需与①不同）（如含有该抗原，则形成Ab②-Ag-Ab①复合物）
6）洗涤（除去多余的、未能特异性结合的抗体②）
7）特异性抗体②可以是酶标记的，也可以不是（本图的情况），而是再通过与anti-抗体②的、且标记有酶的第三个抗体③结合。温育，洗涤。
8）加入底物混合物，一般使用HRP（辣根过氧化物酶），则底物中可含有过氧化氢和TMB，HRP催化过氧化氢生成水，TMB作为其中的质子供体，自身从无色变为蓝色物质，加入酸后，反应终止，TMB变黄色，在450 nm有吸收，可供检测。注意：这种显色反应有许多不同体系可供选择，除颜色变化外，还可有荧光、化学发光等。
蛋白质免疫印迹法WesternBlot：蛋白质样品经凝胶电泳分离后，以特异性抗体检测目标蛋白存在或含量的方法。
基本步骤：
1）蛋白质凝胶电泳
2）转膜（PVDF膜）
3）封闭（脱脂奶粉or BSA 牛血清白蛋白）
4）抗原抗体反应
5）检测
流式细胞术：用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来
对流过光学或电子检测器的一个个（单列）生物粒子（单细胞、细胞器、微珠等）
进行连续的多种参数分析和分选。
生化与分子生物学相关的研究中，流式细胞术常使用荧光标记的抗体：特异性的抗体与靶细胞上的抗原结合后得以检测，从而能够研究这些细胞的特别信息或进行分选（收集）。这在医学（尤其是器官移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学）中具有很广泛的应用
核酸的检测
核酸检测的三个目的：
1）目标核酸分子是否存在
2）核酸分子的含量
3）核酸分子的序列
核酸分子存在的检测方法
1）杂交法
2）PCR法
3）测序法
杂交法：需知道目标核酸的序列，并需要合成一个标记了的特异性探针（DNA、RNA、寡核苷酸等）
杂交法的四种手段
1）Dot blotting：不经过电泳分离，而是把检测样本直接点在一个适宜的薄膜上，利用探针对目标DNA或RNA分子进行杂交检测。
2）Southern blotting：凝胶电泳分离后，针对目标DNA分子的杂交检测。
3）Northern blotting：凝胶电泳分离后，针对目标RNA分子的杂交检测。
4）In situ hybridization：目标DNA或RNA分子原位杂交检测（待测核酸分子在“原位”，如处于组织、细胞、细胞器、病理切片中等。）
探针的选择
1、检测靶序列上的单个碱基改变时可选用寡核苷酸探针；
2、在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或是RNA探针，寡核苷酸探针也可；
3、检测复杂的靶核苷酸序列和病原体应选用特异性较强的长的双链DNA探针；
4、组织原位杂交应选用寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150 p），因为它易透过细胞膜进入胞内或核内。
探针的非放射性同位素标记方法
1）半抗原：地高辛、生物素等，利用这些半抗原的抗体进行免疫学检测。
2）配体：biotin（生物素）标记探针（检测时使用enzyme-linked的avidin或streptavidin。）
3）荧光素：如用异硫氰酸荧光素（FITC）或罗丹明标记抗体，可被紫外线激发出荧
光而被检测到。
4）光密度或电子密度标记物： 金、银
杂交法特点
1）非目标核酸分子也可能与探针分子发生部分结合，可能导致假阳性率偏高
2）杂交法不扩增，易产生假阴性
PCR法：需要知道序列，需要合成一对特异性引物方可进行扩增。扩增结束后（无论多少循环），进行凝胶电泳和染色，即可判断目的DNA序列是否存在，但对于检测初始的DNA序列的浓度（含量、拷贝数）则不准确，定量性能很差
优点：a.灵敏度高b.实验的阴性结果可靠
缺点：实验的假阳性率高
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物——各200µmol/L，序列延伸的原料
引物——各10～100pmol，扩增的起点
模板DNA ——0.1～2 µ g
Taq DNA聚合酶——2.5 U
Mg2+ ——1.5 mmol/L，Taq酶的激活剂
常见问题：只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。
解决办法：1）实验时添加负对照；2）用紫外灯破坏污染物
引物的设计：
1. 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列，从而减少非特异性结合。
2. 引物长度以15-40 bp为宜（过长会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应）。
3. 碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%，上下游引物的GC含量不要相差太大。
4. 引物内部避免形成二级结构（降低引物有效浓度等）。
5. 两引物间避免有互补序列。
6. 引物3’端为关键碱基（不可修饰，避免使用A）；5’端无严格限制（常用来引进修饰位点或标记物）。
Real-timeqPCR
目的：为解决定量问题而发展出的PCR技术。
关键：在PCR反应体系中加入荧光基团，因此在PCR扩增过程中，可通过荧光信号的变化，连续实时地监测整个PCR进程。
关键原理：在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值与其起始拷贝数存在线性关系，因此可从测得的Ct值推算出模板的起始拷贝数，达到了定量检测的目的。
Ct（cycle threshold，循环阈值，阈值循环数）：荧光值到达Threshold时所需要的PCR反应的循环次数。
定量原理：对同一个反应系统来说，初始模板的分子数目决定了到达阈值需要的循环次数（初始分子数多，则需要的循环次数少
基本参数
Baseline：基线，是指PCR反应的最初几个循环（一般为第3至15个循环）间的荧光信号。这期间荧光较弱，受偶然因素影响很大，相当于背景噪音，需要扣除。
Threshold：阈值。也是荧光值，一般是基线标准偏差的10倍（仪器自动设置），实际操作中也可手动设置，处于指数即可。
Ct：cycle threshold，循环阈值，阈值循环数。荧光值到达Threshold时的循环
数，因此这是一个无单位的值。
Real-timeqPCR中荧光基团/探针的引入
1）Tagman聚合酶探针法
在加入一对引物的同时，再加入一个特异的标记了的寡核苷酸探针。该探针设计为可与模板特异性结合（结合位置在两个引物之间），而在该探针的5’端上，标记有一个“荧光报告基团”，在3’端标记一个相应的“荧光淬灭基团”。探针完整时不发出荧光，当核酸序列延长到探针与模板结合处时Taq酶（有5’→3’外切酶活性，双链特异性）遇到探针后，会
将探针5’端的“荧光报告基团”切除。由于在空间上和“淬灭基团”发生分离，因此释放出的“荧光报告基团”分子发射荧光。因此每扩增一条链就会发射一个荧光分子。检测荧光即可定量。
分子信标法（molecularbeacon）：是一种在靶DNA 不存在时就会形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。该探针两端各标记有“报告荧光基团”和“淬灭基团”，中间是能与模板配对结合的序列。与靶DNA结合后，探针结构发生变化，两个基团彼此远离，报告基团的荧光逃离淬灭命运，得以被检测。一个模板可结合一个探针，因此可定量检测模板的增加。
染料法：SYBR Green是一种双链DNA结合染料，当与双链DNA结合后，其荧光大大增强，十分适用于PCR扩增产物的检测。该染料最大吸收波长497 nm，最大发射波长520 nm
游离的染料几乎没有荧光，但遇到DNA双链后就会产生强烈的荧光信号。其结合是定量的。可实时监测扩增的进行。
融化曲线MeltCurve ：PCR过程结束后，将温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链，内掺染料会被释放出来，荧光信号逐渐减弱。将温度对荧光强度的变化求导 (-dI/dT)，得到melt curve峰值代表斜率改变最大时的温度值，即Tm，其值与双链DNA的长度、GC%含量有关，可部分代表序列的特异性
融化曲线的应用：
融解曲线：单一峰、无非特异性荧光，定量准确
融解曲线：出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，定量不准确
引物的设计
常规PCR引物的要求：扩增产物的长度应在80-150bp。
Taqman探针：一般要求尽量靠在上游引物处，长度30-45 bp，Tm值比所用引物至少高5ºC，5’端不要是G（有淬灭作用）等。
