摘要:
目的 构建含人细胞色素P-450 CYP2E1（CYP2E1）基因的缺陷型重组腺病毒载体,检测其协同化疗药物的抗肿瘤效应,为基因介导酶前药治疗提供新的思路.方法 克隆人肝CYP2E1全长cDNA,制备高滴度的重组腺病毒颗粒（1.2×1012 pfu/ml）.分离、培养、传代纯化及鉴定人骨髓间充质干细胞（BMSC）.用Transwell小室检测BMSC向肿瘤细胞的趋化迁移.将重组腺病毒分别转染BMSC和人黑色素瘤细胞A375细胞.荧光显微镜和RT-PCR、Western印迹法分别检测转基因细胞中外源增强绿色荧光蛋白（EGFP）、CYP2E1的表达.倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐（MTT）和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）双染色法检测CYP2E1协同酶前药达卡巴嗪（DTIC）的抗肿瘤效应（实验分A375-CYP2E1组、BMSC-CYP2E1组和BMSC-CYP2E1＋A375组,并以各自空载体组作为对照;细胞接种后分别加入不同浓度DTIC）.结果 成功构建重组腺病毒载体pAd5CMV-NpA-CYP2E1和pAd5CMV-NpA-EGFP.成功分离BMSC,并证明BMSC可通过聚碳酸酯膜分别向下室内的K562和A375细胞迁移.荧光显微镜检测到转基因靶细胞EGFP表达,RT-PCR和Western印迹法均检测到目的基因在转基因细胞中高表达.倒置显微镜下见加入DTIC后BMSCCYP2E1＋A375组的死亡细胞明显多于对照组.MTT法示DTIC呈浓度依赖性抑制转CYP2E1基因的细胞生长,其中BMSC-CYP2E1＋A375组药物半数抑制量（IC50）值为（0.17±0.13）mmol/L,其对照组为（0.65±0.20）mmol/L,二者差异有统计学意义（P＜0.01）,可选0.05 mmol/L DTIC浓度作人BMSC的相对安全浓度.Annexin V/PI法示0.05 mmol/L DTIC处理细胞48 h后BMSC-CYP2E1＋A375组细胞凋亡率明显高于其对照组（26.8±2.0比8.7±1.3,P＜0.01）.结论 BMSC体外具有向肿瘤细胞趋化迁移的特性.重组腺病毒载体介导的CYP2E1转染BMSC具有协同化疗前药的抗肿瘤效应.
