摘要:
背景腺相关病毒（AAV）作为治疗载体能够长期稳定地表达治疗基因，但对视网膜色素上皮（RPE）细胞的转染效率较低，探讨提高AAV对RPE细胞转染效率的方法是目前研究的热点之一。目的探讨少垃腺病毒对AAV转染RPE细胞的作用。方法从成人供体眼杯巾以胰蛋白酶消化法分离RPE细胞，并将其在含有质量分数10％胎牛血清的DMEM培养液中原代培养30d。采用携带报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的2型血清型AAV2 1×10^4感染复数（MOI）转染细胞作为AAV2-EGFP组，在加入上述物质的同时，加入不同滴度的非复制型腺病毒（Ad-null）作为AAV2-EGFP＋Ad-null组。转染后采用倒置荧光显微镜观察并计数EGFP阳性细胞，采用Westernblot法检测转染细胞巾EGFP表达量的变化。结果分离的RPE细胞富含色素颗粒。AAV2-EGFP转染RPE细胞后第2天EGFP开始表达，至第12天达高峰，之后维持在较高的水平至23d。荧光显微镜下可见随着Ad-null滴度的增加，AAV2-EGFP＋Ad-null组中各滴度时EGFP阳性的RPE细胞数和平均荧光强度显著增加，显示出明显的剂量效应关系。联合0．1MOI的Ad-null即可见显著的增强作用，至10MOI时达高峰，但当Ad-null滴度提高至100MOI以上即出现显著的细胞毒性作用。Westernblot检测显示，EGFP在细胞中的蛋白表达水平AAV2-EGFP＋Ad-null组较AAV2-EGFP组明显提高。结论联合使用少量腺病毒可明显增强AAV对人RPE细胞的转染，为今后应用AAV作为载体携带外源基因治疗视网膜色素变性和新生血管性疾病提供了实验依据。
