摘要:
目的为建立能稳定表达人P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的马丁达比狗肾上皮（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞转基因细胞系,并鉴定其是否适用于药物转运实验。方法将质粒pcDNA3.1（＋）/MDR1通过LipofectamineTM2000转染试剂转染犬肾上皮细胞MDCK,经G418筛选获得抗性克隆。通过P-gp的荧光底物罗丹明（Rhodamine123,Rho123）在各单克隆细胞内的积聚量以及维拉帕米存在时细胞内积聚量检测P-gp的活性。反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Westernblot）检测人源多药耐药基因1（multidrug resistance1,MDR1）的mRNA和P-gp表达量。应用筛选出的MDCK-MDR1单克隆细胞株,研究了Rho123在MDCK和MDCK-MDR1（Madin-Darby canine kidney/multidrug resistance1）细胞中的转运及4种经典抑制剂（维拉帕米、环孢素、酮康唑和奎宁）对Rho123转运的抑制特性。结果RT-PCR和Western blot检测表明,所建立的MDCK-MDR1细胞与MDCK细胞相比,经转染后MDCK细胞内的MDR1的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）和P-gp表达发生从无到有的变化。Rho123在MDCK和MDCK-MDR1中的外排系数分别是5.94和15.45,抑制剂能显著地抑制细胞外排作用。结论转染后的细胞高表达P-gp,适用于研究药物的肠道和血脑屏障转运实验。
