摘要:
目的:初步探索MBL基因CGT52TGT点突变引起调理吞噬缺损的机制.方法: 采用PCR技术, 从质粒pMBL m52中获取含CGT52TGT点突变的MBL基因, 将其插入真核表达载体pcDNA4/HisMax C中构建重组表达载体.经测序验证后, 电转染入CHO细胞.以800 mg/L Zeocin筛选转染后的CHO细胞30 d; 随后的30 d中, 维持Zeocin的浓度在200 mg/L, 以获取稳定转染的细胞.以RT-PCR分析其mRNA 的表达情况.表达产物经Ni-NTA agarose纯化后, 以非还原SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行初步鉴定.结果: 以PCR扩增的MBLm52基因片段长约750 bp, 将其插入表达载体构建重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm52, 测序验证序列正确后将其电转染入CHO细胞.从细胞培养上清中获得的纯化的表达产物, 主要为相对分子质量(Mr)约60 000 的分子, 寡聚化程度明显低于重组人野生型MBL和从人血浆中分离的MBL.结论: MBL基因CGT52TGT点突变可能并不影响其表达产物向胞外分泌的过程, 但突变后产生的Cys可能形成新的二硫键, 影响MBL结构单位和/或寡聚分子的形成, 推测该突变MBL蛋白不能发挥正常的功能.
