摘要:
由于从环境样品中分离和培养细菌的困难,分子生物学方法已发展用来描述和鉴定微生物群落.近年来基于DNA方法的群落分析得到了迅速的发展,如PCR扩增技术,克隆文库法,荧光原位杂交法,限制性酶切片段长度多态性法,变性和温度梯度凝胶电泳法.DGGE 已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌,古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性.这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品.具有可重复和容易操作等特点,适合于调查种群的时空变化,并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员.DGGE分析微生物群落的一般步骤如下:一是核酸的提取,二是16S rRNA, 18S rRNA或功能基因如可容性甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmoX)和氨加单氧酶α-亚单位基因(amoA)片段的扩增,三是通过DGGE分析PCR产物.DGGE使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶,该凝胶能够有区别的解链PCR扩增产物.由PCR产生的不同的DNA片段长度相同但核苷酸序列不同 .因此不同的双链DNA片段由于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移[5].DNA 解链行为的不同导致一个凝胶带图案,该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓.DGGE 使用所有生物中保守的基因片段如细菌中的16S rRNA 基因片段和真菌中的18S rRNA 基因片段.然而同其他分子生物学方法一样,DGGE也有缺陷,其中之一是只能分离较小的片段,使用于系统发育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制.在某些情况下,由于所用基因的多拷贝导致一个种类多于一条带,因此不易鉴定群落结构到种的水平.此外,该技术具有内在的如单一细菌种类16S rDNA拷贝之间的异质性问题,可导致自然群落中微生物数量的过多估计.DGGE是分析微生物群落的一种有力的工具.不过为了减少DGGE和其它技术
